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斑馬魚胚胎顯微注射實(shí)驗(yàn)操作方法

更新時(shí)間:2023-02-27   點(diǎn)擊次數(shù):3700次

斑馬魚胚胎顯微注射實(shí)驗(yàn)操作方法

顯微注射技術(shù)是在顯微鏡下,利用顯微操作系統(tǒng),控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動(dòng),對進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。該技術(shù)已經(jīng)在越來越多的實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究領(lǐng)域中成為一項(xiàng)普遍的操作技術(shù),并成功運(yùn)用于包括小鼠、大鼠、兔子、斑馬魚及許多大型家畜,如牛、羊、豬等動(dòng)物中。


斑馬魚顯微注射是將實(shí)驗(yàn)材料直接注射到1-4細(xì)胞期的斑馬魚胚胎中,由于在這個(gè)胚胎發(fā)育早期沒有膜分隔細(xì)胞和卵黃,注入1個(gè)細(xì)胞或卵黃的溶液將擴(kuò)散到整個(gè)胚胎中。通過注射不同類型的實(shí)驗(yàn)樣品,實(shí)現(xiàn)基因的瞬時(shí)過表達(dá)(over-expression)、表達(dá)敲減(knock-down)、以及制備轉(zhuǎn)基因或突變斑馬魚品系等研究。

 

一、   胚胎顯微注射技術(shù)的應(yīng)用



斑馬魚作為一種新興的理想的模式生物,在生命科學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用,斑馬魚胚胎顯微注射技術(shù)是這些應(yīng)用研究的基礎(chǔ)技術(shù)平臺(tái)之一。通過顯微注射不同的實(shí)驗(yàn)樣品,可以實(shí)現(xiàn)以下不同的目的。


(一)可以通過注射體外合成的mRNA實(shí)現(xiàn)目的基因的過表達(dá),并通過觀察表型推測目的基因的功能。


(二)可以通過注射反義嗎啉環(huán)寡核苷酸(morpholino)敲減目的基因的表達(dá)。morpholino是穩(wěn)定的人工合成的核酸類似物,通過標(biāo)準(zhǔn)的堿基互補(bǔ)配對與mRNA結(jié)合,阻斷蛋白翻譯或mRNA剪切。與過表達(dá)相反,這種方法導(dǎo)致mRNA蛋白產(chǎn)物減少,可以通過該蛋白減少時(shí)對生物學(xué)過程的改變來解釋目的基因在發(fā)育中所扮演的角色。


(三)基因敲除(knock-out)品系的研制。基因敲除品系是在活體動(dòng)物上開展基因功能研究的重要工具。CRISPR-Cas9技術(shù)是一種高效、快速的構(gòu)建敲除品系的新方法。這個(gè)技術(shù)的原理是通過人工設(shè)計(jì)出sgRNA,sgRNA能夠通過堿基配對識(shí)別目標(biāo)序列,然后引導(dǎo)體外合成的核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白在目標(biāo)靶點(diǎn)產(chǎn)生切割。DNA斷裂后,細(xì)胞將通過非同源末端接合(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來進(jìn)行修復(fù),將斷裂的DNA重新連接起來,在這個(gè)過程中會(huì)產(chǎn)生DNA堿基的插入或缺失的錯(cuò)誤,從而引起DNA突變。


(四)轉(zhuǎn)基因品系的研制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中,由于導(dǎo)入基因的表達(dá),引起生物體的性狀產(chǎn)生可遺傳的修飾。在轉(zhuǎn)基因品系研制中,轉(zhuǎn)基因載體是承載外源基因,攜帶靶基因進(jìn)入斑馬魚胚胎細(xì)胞,并將目的基因整合到斑馬魚基因組使其穩(wěn)定維持的DNA分子。顯微注射是制備轉(zhuǎn)基因斑馬魚過程中常用的方法。

 

二、 顯微注射系統(tǒng)的搭建


斑馬魚顯微注射需有一套相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備,主要包括以下幾種(圖4.1):


4.1顯微注射常用設(shè)備。A: SUTTERP-1000微電極拉制儀; B: ASI顯微注射儀MPPI-3;

C: 持針器和顯微操作儀MM33; D:體視顯微鏡

 

微電極拉制儀用于拉制毛細(xì)管成注射針,可以調(diào)節(jié)的溫度、拉力、拉制時(shí)間等參數(shù)拉制出合適針尖的注射針,為了防止空氣中灰塵顆粒沾染注射針引起針尖阻塞,注射針現(xiàn)用現(xiàn)拉。


顯微注射儀用于注射針內(nèi)的溶液施加壓力脈沖,利用可調(diào)節(jié)氣壓脈沖將精準(zhǔn)體積的樣品注射至胚胎體內(nèi)。注射器還和一個(gè)腳踏板相連,使得實(shí)驗(yàn)人員在使用雙手的同時(shí)還可以激活壓力脈沖將實(shí)驗(yàn)材料注射入胚胎中;


持針器用于固定在注射過程中使用的注射針,并將它與注射器的空氣管相連,常裝在顯微操作器上;


顯微操作儀用于注射針的顯微操縱,可以在顯微注射過程中對注射針的位置進(jìn)行細(xì)小和精準(zhǔn)地調(diào)節(jié);


體視顯微鏡用于顯微注射時(shí)觀察胚胎,可以在顯微注射過程中看到胚胎并對注射針?biāo)诘奈恢镁劢埂?/span>

 

三、 顯微注射過程及注意事項(xiàng)

顯微注射技術(shù)是一個(gè)相對精細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作,主要有以下步驟。

(一)準(zhǔn)備注射用的胚胎


注射的前1DAY,按照雌:雄為1:12 :1的比例將成年斑馬魚放置于配種缸,用隔板分開(圖2.3)。


注射的早上,抽去隔板,雌雄魚開始交配。一般在十多分鐘左右親魚產(chǎn)卵并使卵受精。一般一次抽板2缸魚左右,隨后根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度適時(shí)給其它缸抽板??稍诔榘迩跋葘?nèi)缸連同親魚換到另一干凈外缸中以節(jié)約清潔胚胎的時(shí)間。


親魚產(chǎn)卵后,取180μm孔徑的過濾網(wǎng),收集外缸底部的魚卵,并用養(yǎng)殖水清洗魚卵2-3次。應(yīng)盡量收集20 min內(nèi)的受精卵(即對于同一缸親魚,兩次收集受精卵的時(shí)間間隔不得超過20分鐘,以保證發(fā)育階段的一致性)。受精卵分選和洗凈后,用吸管將收集的卵置于平板培養(yǎng)皿中,去除平皿內(nèi)的異物和胚胎周圍的水,采用干法注射。


胚胎在受精后10分鐘卵膜將膨脹,隨后數(shù)分鐘內(nèi)細(xì)胞形態(tài)變得較為規(guī)整(容易找到動(dòng)物極),此時(shí)可以開始注射。受精后45分鐘左右(標(biāo)準(zhǔn)培育溫度下所需時(shí)間,具體情況同室溫有關(guān))發(fā)生一次卵裂。樣品通常需要注射到1-4細(xì)胞時(shí)期胚胎,以下上樣、斷針、定量和注射都要在此段時(shí)間內(nèi)或在此之前完成。

 

(二)拉針、上樣和儀器準(zhǔn)備工作




1、拉針。使用微電極拉制儀拉制一定數(shù)量的毛細(xì)管,應(yīng)提前準(zhǔn)備。



2、可以提前準(zhǔn)備,樣品通常包括質(zhì)粒DNA、RNA、morpholino等。

DNA質(zhì)粒樣品:質(zhì)粒DNA需使用去內(nèi)毒。素"的試劑盒提取。一般注射量為每枚胚胎20-150pg,多于200pg胚胎死亡率上升。

mRNA樣品:一般注射量為每枚胚胎10-500pg,針對不同的mRNA樣品,需要摸索各自適宜的濃度。

Morpholino樣品:參見GeneTools公司隨樣品提供的說明書。通常產(chǎn)品總量為300nmol一瓶,約相當(dāng)于2400μg,加入200μL滅過菌的去離子水(電阻率>18MΩ/cm)稀釋至12μg/μL,每管20μL分裝作為儲(chǔ)液凍存在-20℃。注射時(shí)取一管稀釋至0.5-6μg/μL (ng/nL)左右。針對不同的morpholino,需摸索各自合適的濃度,以獲得理想的表型而不產(chǎn)生毒性效應(yīng)為宜。在使用新的morpholino時(shí),必須慎重考量該morpholino的有效性和特異性。


所有樣品使用前需要先離心,使可能存在的固體懸浮物沉淀到管底,避免堵住針頭。一般可以在注射樣品中加入終濃度10%-20%的酚紅,便于觀察注射過程。



3、上樣裝針。將拉制好的毛細(xì)管豎直固定。然后吸取1-3μl顯微注射液,逐滴地將注射液滴在毛細(xì)管頂端,在毛細(xì)管內(nèi)芯引導(dǎo)下,液體通過虹吸作用將匯聚于玻璃管針頭部分。如果使用的毛細(xì)管沒有內(nèi)芯,可以使用微量上樣移液槍頭上樣。上樣體積至少為1μL,一定不要在針內(nèi)引入空氣柱,否則會(huì)難以控制注射量。


4、打開顯微注射儀。以MPPI-3脈沖壓力注射儀為例。打開氮?dú)夤蘅傞y,調(diào)節(jié)壓力至0-0.5之間。打開注射儀開關(guān),調(diào)節(jié)主操作面板上的壓力值為10-20左右,選擇合適的注射壓力和脈沖時(shí)間。(圖4.2

 

4.2 全套搭建好的顯微注射設(shè)備(左側(cè))和破針操作(右側(cè))

 

(三)注射斑馬魚胚胎



1、破針。將上好樣品的注射針插入持針器中固定,然后在體視鏡高倍放大率下,用尖頭鑷子將注射針的前端夾斷。(圖4.2

2、注射劑量調(diào)整。把臺(tái)微尺放置到體視顯微鏡下,加入一滴礦物油,將注射針伸入礦物油中,踩動(dòng)踏板壓將一滴注射液送到礦物油,測量注射樣品的大小。注射體積與針尖大小、注射壓力、注射時(shí)間、溶液粘度和外部壓力有關(guān),理想的注射劑量為胚胎體積的10%,一般為1nL(注射樣品的直徑在10個(gè)小格左右)。注射劑量過大體積會(huì)損傷胚胎,過小可能影響定量精準(zhǔn)度和擴(kuò)散的均勻程度。

3、注射。將收集的胚胎放置到體視顯微鏡鏡下,用低倍物鏡對準(zhǔn)胚胎調(diào)焦,輕輕的落下針尖,并將注射針尖推入視野中心,通過微操作系統(tǒng)的微調(diào)調(diào)整注射針位置,直到清晰見到針尖為止。進(jìn)一步調(diào)整顯微鏡焦距和注射針及胚胎的位置,使胚胎和注射針尖均達(dá)到非常清晰程度。推動(dòng)操縱桿,小心進(jìn)針,使注射針針尖進(jìn)入胚胎。腳踏開關(guān)將樣品注入胚胎。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),先關(guān)閉氮?dú)夤蘅傞y(逆時(shí)針變松為關(guān)),排空儀器中的氣體后,關(guān)閉總開關(guān)。


(四)注射胚胎的培養(yǎng)和觀察


1、胚胎養(yǎng)殖。注射結(jié)束后,將胚胎轉(zhuǎn)移至養(yǎng)殖水中,置入28?C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待胚胎發(fā)育2小時(shí)后,顯微鏡下挑出未受精的胚胎和死亡的胚胎。孵化期間每天要及時(shí)去除敗育胚胎,勤換水。

2、胚胎麻醉和固定。麻醉劑可以使魚類代謝減緩,鰓動(dòng)頻率下降,氧的需求量減少,從而方便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。通常將斑馬魚浸泡于0.016%Tricaine中進(jìn)行麻醉。待胚胎麻醉后,利用4%的甲基纖維素固定胚胎,將胚胎調(diào)整到合適的位置。廢棄的顯微注射針的尖兒端燒溶后可以用于調(diào)整胚胎。

3、胚胎觀察。為了便于觀察顯微注射的結(jié)果,本次培訓(xùn)使用質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)chordin mopholino作為注射練習(xí)的材料。質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)注射后,胚胎發(fā)育至1天時(shí),在肌肉中特異表達(dá)綠色熒光蛋白;chordin mopholino注射后的胚胎出現(xiàn)腹部化(ventralization)。(圖4.3

 

4.3 顯微注射后24hpf胚胎的照片。胚胎發(fā)育至1天時(shí),注射質(zhì)粒pT2(tpma:EGFP)的胚胎在肌肉細(xì)胞中特異表達(dá)綠色熒光蛋白(A);注射chordin mopholino的胚胎產(chǎn)生腹部化表型(B)。


顯微注射的注意事項(xiàng)


顯微注射的操作過程中有許多細(xì)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)的成功率,需要特別關(guān)注,主要包括以下幾方面。


1、注射樣品的質(zhì)量和和濃度。顯微注射的樣品種類繁多,包括mRNADNA或蛋白質(zhì)等,但是注射樣品是否純凈是關(guān)系到注射效率高低的重要因素之一。此外,注射樣品的濃度不易太高,例如注射DNA的總濃度一般控制在200pg以下。


2、注射前小心將顯微注射針定位,注射針定位到卵表面的注射角度是穿透堅(jiān)硬的卵殼注射成功的關(guān)鍵。


3、破針時(shí),將針尖一點(diǎn)點(diǎn)剪斷,不宜一次剪太多。顯微注射針尖如果太粗,會(huì)導(dǎo)致DNA流量過多,受精卵易于裂解;太細(xì)則導(dǎo)致針內(nèi)DNA流出速率過慢,且易堵塞針尖,而使DNA無法順利流入,影響注射效率。因此進(jìn)行顯微注射時(shí),如何制備適用的顯微注射針是顯微注射效率極其重要的因素。


4、在注射過程中,常發(fā)生注射針堵塞,堵塞后,通常可通過輕夾針尖、增大輸出壓力或按pulse/CONT開關(guān)而得以緩解。如果不能解決,換用新的注射針。


5、注射時(shí)注射器的壓力不宜變化太快,否則會(huì)造成注射量操作難以控制,導(dǎo)致胚胎內(nèi)環(huán)境改變過快過大甚至脹破細(xì)胞。氮?dú)夤薜膲毫﹂y顯示氣體的壓力,壓力為0表明罐內(nèi)無氣體,需要及時(shí)換氣。


6、注射完畢,慢慢抽出注射針,要一氣呵成,避免受精卵內(nèi)物質(zhì)隨著毛細(xì)針抽出,造成受精卵的損傷。


7、在整個(gè)過程中,嚴(yán)禁將注射針尖對著人員和儀器,因?yàn)樽⑸溽樤诔轴樒魃习惭b不牢時(shí)或針尖堵塞,注射器、管子及注射針內(nèi)的壓力,可能將注射針射出傷人。


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